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上皮細胞培養_干細胞搜網_www.stemcell.so

更新時間:2014-05-13

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干細胞搜網實驗室人員教您如何做好 上皮細胞培養

 

1)表皮細胞培養
1.取材:取外科植皮或手術殘余皮膚小塊,以角化層薄者為佳,早產流產兒皮膚更好,切成0.5~1平方厘米小塊。
2.EDTA處理:先置入0.02%EDTA中室溫置5分鐘。
3.冷消化:換入0.25%胰蛋白酶中,置4℃過通宵。
4.分離:取出皮膚,用血管鉗或鑷子把表皮與層分開。
5.溫消化:取出表皮單獨處理,用剪刀剪成更小的塊后,置入新的0.25%胰蛋白酶中,37℃再消化30~60分鐘。
6.用吸管輕輕反復吹打,使成細胞懸液。
7.培養液:通過80目不銹鋼紗網濾過后,低速離心,吸上清,直接加入Eagle液和20%小牛血清,制成細胞懸液,接種入碟皿中,CO2溫箱培養。

 

2) 乳腺組織培養
直接培養法:(適于培養含纖維少的軟組織)
1.在含有少量培養液或Hanks液的容器中,用鋒利刀片將組織反復切割成碎塊。
2.把組織碎塊連同液體注入離心管中,再補加少許培養液,用吸管吹打片刻,置試管架3~5分鐘。吸除上層液可排除非乳腺細胞部分。重復2~3次。
3.末次處理結束后,向沉降管中再補加培養液,用吸管稍吹打,使沉降物重懸。不待細胞團塊下降立即通過3~4層無菌紗布濾入另管中。
4.調整好適宜密度,接種入培養瓶中培養。

膠原酶消化法:(適于處理含纖維多的較硬組織)
其過程與培養其它組織相同。

 

3) 胃上皮細胞培養
1.取材:取胃潰瘍或胃癌手術切除胃標本遠端非病變區粘膜少許。
2.清洗:用含慶大霉素(400微克/毫升)和二性霉素(2微克/毫升的Hanks)液漂洗后,用鈍器剝離下粘膜,剪成1mm3大小。
3.消化:在I型膠原酶和透明質酸酶中,于37℃中消化80分鐘。
4.離心:收集細胞懸液,800轉/分離心后,Hanks液漂洗兩次。
5.接種:末次離心后加入含有1%~2%胎牛血清的*培養基,接種入不同孔數的培養板中,接種量依不同實驗目的而定。

4) 肝細胞培養
初代組織塊培養:
取新鮮肝臟,先剝除被膜和血管等纖維成分,用刀或剪刀把肝臟剪成1mm3左右的小塊,采用帖壁培養法。

 

初代消化法培養:
1.把肝組織切成2~4立方毫米的小塊,用不含鈣鎂的BSS液洗兩次。
2.移入1:1的0.1%胰蛋白酶和0.1%膠原酶(都用無鈣鎂BSS配置)中,4℃冷消化10~12小時后,通過250微米和64微米尼龍網或不銹鋼紗網濾過。
3.收集細胞、BSS液洗1~2次、計數、接種培養。
消化培養肝細胞的另一種方法是灌流法;肝臟灌流需用全肝,以較小動物如小鼠和大鼠為好。
1.無菌解剖動物,取出肝臟,先用BSS洗除血污。
2.取5ml注射器一支,吸取消化液后,把注射器頭輕輕插入肝管中,用線繩結扎牢固,以防消化液漏出,輕輕把消化液注入肝管系統,并不時輕揉壓肝臟,以便消化液進入肝小葉中;消化液在肝內停留20~30分后,在吸出消化液的同時并輕揉壓肝臟,以使肝細胞脫落和消化液吸出。
3.待吸凈消化液后,注入離心管中,低速離心分離,用RPMI 1640培養基培養(較其它培養基為好),能獲得較純的肝上皮細胞和獲較好的效果。

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